!-- -->
Minggu, 20 November 2011 - 15:34:43 WIB
PREDIKSI STRUKTUR LUCIFERASE BAKTERI LUMINISENSI Photobacterium phosphoreum
Diposting oleh : Administrator
Kategori: Jurusan Fisika - Dibaca - : 13515 kali

PREDIKSI STRUKTUR LUCIFERASE BAKTERI LUMINISENSI Photobacterium phosphoreum

 

Ratnawulan

Staf Pengajar Jurusan Fisika FMIPA Universitas Negeri Padang

 

ABSTRACT

 

The three-dimensional structure of 231 residues of the betha and alpha-chain of luciferase was modeled from coordinates of flavoprotein and then energy minimized. The predicted three-dimensional structure of  both subunits of bacterial luciferase Photobacterium phosphorium is in accordance with a 8 alpha/beta-barrel structure. The model obtained satiffies the criteria for the structure of a globular protein. From the model it is possible to predict active site residues involved in binding and the visible light emission in bacteria Photobacterium phosphorium. Lysine (lys-H+) and asparagin (Asn) were predicted as representative catalytic residues involved in the protonation and deprotonation processes.

 

Keywords : Structure, bacterial luciferase, Photobacterium phosphorium, model

 

PENDAHULUAN

 

Cumi-cumi diperairan Indonesia diketahui ternyata bisa memancarkan  cahaya yang membantu cumi-cumi itu mencari makanan di kegelapan air, sekaligus menjadi alat penyamaran (kamuflase) dari hewan pemangsa. Pringgenies (2003) telah melakukan penelitian tentang cumi ini dan menyimpulkan bahwa cahaya yang dipancarkan disebabkan karena adanya hubungan simbiosa antara cumi dengan bakteri yang hidup didalamnya. Bakteri tersebut merupakan jenis dari photobacterium phosphoreum yang hidup di dalam organ cahaya cumi-cumi jenis Laligo duvaucelli.  

Pemancaran cahaya pada bakteri luminisensi dikatalis oleh enzim yang dinamai luciferase. Luciferase ini bekerja mereduksi flavin mononukleotida bentuk tereduksi (FMNH2) sebagai substrat untuk menghasilkan cahaya tampak (Fisher et.al, 1996).

Pada saat ini telah dilakukan kajian tentang karakteristik pemancaran cahaya dari luciferase bakteri Photobacterium phosphoreum  (LBPP) ini berupa  jumlah foton yang dipancarkan persatuan waktu,  panjang gelombang, dan pengaruh temperatur, pH, konsentrasi oksigen, dan polutan terhadap intensitas pemancaran cahaya. Walaupun  hasilnya telah dapat menjelaskan pola-pola aktivitasnya secara lengkap, tapi belum dapat menjelaskan mekanisme pemancaran cahaya dari bakteri karena diperlukan data struktur dari LBPP dan sisi aktifnya yang merupakan pusat aktivitas dari luciferase .

Salah satu penyelidikan  yang paling lengkap untuk menjelaskan struktur LBPP dan sisi aktifnya adalah menggunakan metode difraksi sinar-X. Namun metode ini mempunyai tingkat kesulitan yang tinggi dan memakan waktu yang lama. Studi teoritik dari LBPP yang didasari pada perhitungan medan gaya empiris menggunakan metode mekanika molekul (MM) dapat  dijadikan sebagai studi pendahuluan untuk mengetahui model struktur LBPP dan prediksi residu-residu yang berfungsi sebagai sisi aktif. Asumsi yang dipakai pada penelitian ini adalah  perubahan susunan atom setelah LBPP mengikat substrat menyebabkan terjadinya perubahan parameter-parameter geometri yang dapat  dipresentasikan oleh perbedaan energi potensial total antara LBPP dengan substrat .

 

METODE PENELITIAN

 

Luciferase adalah enzim heteropolimerik yang mengkatalis perubahan energi kimia ke energi cahaya dalam bakteri bioluminisensi. Enzim ini mengandung dua sub unit yang tidak identik ( a dan b).

Data input luciferase Photobacterium phosphoreum yang digunakan dalam penelitian ini adalah dari strain yang lain yang didapat dari Protein Bank data (PDB) kode ID 1FVP (flavoprotein), dari Kita., et.al., (1995). Flavoprotein ini ditemukan Kasai (1987) selama pemurnian luciferase dari Photobacterium phosphoreum dan mempunyai urutan asam amino yang identik dengan sub unit a dan b.

Medan gaya  empiris yang digunakan dalam penelitian ini memakai metode mekanika molekul (MM) dimana suatu molekul terbentuk dari ikatan-ikatan antara atom-atom dengan sudut dan panjang ikatan antara atom dengan sudut dan panjang tertentu sehingga geometri ruang struktur senyawa yang terbentuk menghasilkan energi sterik minimum.

Dalam teori MM, energi potensial total suatu molekul diperoleh sebagai jumlah semua interaksi yang terjadi dalam molekul. Energi potensial dalam molekul terdiri atas; energi ikatan ulur (streching, Estr), energi tekuk (bending, Ebnd), energi torsi (Etor),  energi improper (Eimp), energi vander Walls (Evdw), dan energi elektrostatik (Eel), yang dirumuskan dalam persamaan berikut:

                   (1)

Pada persamaan (10, b0 dan q0 menyatakan ikatan dan sudut dalam keadaan keseimbangan, kb, kq, kc dan ke menyatakan konstanta gaya ikat, sudut, torsi dan improper, n menyatakan perkalian atau periodesitas dari bentuk torsi, d menyatakan fase dari bentuk torsi. qi  dan qj adalah muatan atom i dan j, e0 adalah konstanta dielektrik, rij adalah jarak antara atom i dan j, dan eij dan Rminij  adalah kedalaman sumur potensial dan jarak interaksi minimum yang melukiskan interaksi vander Walls antara atom i dan j.

Cara kerja dalam memodelkan struktur LBPP dengan MM adalah pertama memilih konformasi awal, dimana konfirmasi awal yang dipilih adalah sesuai dengan koordinat flavoprotein. Selanjutnya melalui penambahan (x, y, z) yang acak pada setiap koordinat kartesian dan melalui pemutusan acak dengan sudut torsi yang dipilih secara acak dihasilkan komponen baru dan dilanjutkan dengan peminimuman energi untuk mendapatkan struktur yang stabil.

Ketelitian ramalan dan keandalan suatu medan gaya mekanika molekuler ditentukan oleh fungsi potensial dan parameter yang digunakan. Energi minimum dicapai dengan menggunakan sejumlah iterasi, yang tergantung sejauh mana koordinat awal menunjukkan geometri yang diminimalkan dan sejauh mana potensial cukup baik menggambarkan medan gaya. Program komputasi yang digunakan adalah GROMOS 96 yang tergabung dalam Swiss PDB-Viewer.

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

 

Prakiraan awal struktur LBPP sebelum dan sesudah mengikat substrat.  diperlihatkan pada Gambar 1

 

(a)

 (b)

Gambar 1. Hasil analisis struktur 3D  data LBPP menggunakan program Swiss PDB-Viewer (a) sebelum dan (b) setelah  mengikat FMNH2

 

Dari Gambar 1 (a) dan (b) terlihat bahwa struktur LBPP terdiri dari 8 lop sub unit a helix dan 8 lop sub unit b sheet yang disingkat 8 (alpha/betha-barrel) dan oleh karenanya memenuhi kriteria sebagai struktur dari protein globular.

Untuk menguji akurasi model digunakan plot Ramachandran. Nilai-nilai phi-psi dari residu-residu selain glysin (karena glysin tidak mempunyai rantai sisi)  harus berada didalam daerah yang diperbolehkan. Hasilnya dapat dilihat pada Gambar 2 dimana hampir semua residu berada dalam daerah yang diperbolehkan.

 

Gambar 2. Plot Ramachandran LBPP

 

 Untuk menentukan residu-residu sisi aktif dari LBPP maka perbedaan energi potensial total LBPP sebelum dan setelah mengikat FMNH2 dihitung dan hasilnya dibandingkan seperti yang diperlihatkan pada Gambar 3

Gambar 3. Perbedaan energi LBPP sebelum dan sesudah mengikat FMNH2 (residu 1= MET1; 2=ASN2; 3= LYSH3; 4= TRP5; 5 =TYR6; 6=GLY7; 7=VAL8; 8=PHE9; 10 = PHE10, residu –residu lain tidak nampak digambar tetapi mempunya DE = 0 kJ/mol)

 

Berdasarkan Gambar 3 dapat disimpulkan bahwa Asn2 dan LysH3 mempunyai perbedaan energi potensial total yang signifikans sebelum dan setelah LBPP mengikat FMNH2. Ini berarti kedua residu tersebut dipilih sebagai sisi aktif dengan Asn2 sebagai representasi basa yang berfungsi sebagai penerima proton (deprotonasi) dan LysH3 sebagai representasi asam yang berfungsi sebagai pemberi proton (protonasi).  Hasil ini sesuai dengan prediksi yang dilakukan Wada, et.al (1999). Sisi pengikatan substrat pada residu sisi aktif dapat disimpulkan dari Gambar 1 (b)  yaitu pada kedudukan N(1) pada FMNH2 menuju Asn pada posisi COO- dan  pada atom N pada terminal LysH ke sisi C4a pada substrat FMNH2 .

Penelitian selanjutnya adalah menghitung energi potensial total akibat interaksi antara Asn2 dan LysH dengan FMNH2 dengan cara menvariasikan semua  parameter-parameter geometri pada sisi aktif terhadap substrat dan hasilnya dapat dillihat pada Gambar  4

(a)

(b)

Gambar 4. Kurva energi potensial total (a) Asn dan (b) LysH saat mendekati FMNH2.

 

Gambar 4 (a) memperlihatkan bahwa energi potensial bertambah secara cepat pada saat Asn2 mendekati FMNH2 pada jarak R=2,7A  dan energi barriernya adalah Ea= 37kJ/mol.  Diduga pada jarak ini, sebuah proton ditransfer dari kedudukan N(1) pada FMNH2 menuju Asn pada posisi COO- . Pada Gambar 4  (b) tidak terlihat adanya barrier energi ketika proton ditransfer dari atom N pada terminal LysH ke sisi C4a pada substrat FMNH2 pada R = 7.27A.

 

KESIMPULAN

 

               Berdasarkan hasil penelitian dan pembahasan dapat dikemukakan tiga hasil utama dari penelitian ini yaitu:

1.        Perbedaan energi potensial total LBPP setelah dan sebelum mengikat FMNH2 menunjukkan bahwa  residu Asn2 sebagai representasi basa yang berfungsi sebagai penerima proton (deprotonasi) dan LysH3 sebagai representasi asam yang berfungsi sebagai pemberi proton (protonasi). 

2.        Kemungkinan terjadi transfer proton  pada N(1) pada sisi FMNH2 menuju COO- pada sisi Asn2 pada jarak R=2,7A  dan energi barrier Ea= 37kJ/mol dan selanjutnya transfer proton terjadi pada atom N terminal LysH menuju C4a pada sisi FMNH2 pada R = 7.27A tanpa energi barrier.

3.        Untuk mendapatkan gambaran yang lebih detail tentang interaksi antara LBPP dengan subtrat-subtratnya, maka  penelitian ini perlu dilanjutkan dengan metode orbital molekul.

 

DAFTAR PUSTAKA

 

Pringgenies, D., (2003), Kehadiran bakteri pada organ cahaya cumi-cumi Loligo duvauceli, Disertasi, PPs-ITB

Fisher, A.J.,Thompson, T.B., Thoden, J.D., Baldwin, T.O., and Rayment,I., (1996),The 1,5 A Resolution crystal structure of bacterial Luciferase  in low salt conditions, The Journal of Biological Chemistry, 271(36): 21956-219678

Kita, A., Kasai,,S., Miki,K., (1995),  Crystal structure determination of a flavoprotein FP390 from a luminescent bacterium, Photobacterium phosphoreum, The Journal of Biological Chemistry,117(3):575-8

Kasai, S., Matsui, K., and Nakamura, T. (1987) Purification and some properties of FP390 from P. Phosphoreum in Flavin and Flavoprotein 1987 (Edmonton, D.E and Mccormic, D.B., eds), Walter de Gruyter, Berlin and New York ,647-650.

Wada,N., Sugimoto., T., Watanabe,H., and Tu,S.C., (1999),  Computational Analysis of the Oxygen Addition at the C4a Site of Reduced Flavin in the Bacterial Luciferase Bioluminescence Reaction, Photochemistry and Photobiology,  70(1): 116–122

Komentar :



Isi Komentar :
Nama :
Website :
Komentar
 
 (Masukkan 6 kode diatas)